Chủng giống
Gentamicin là kháng sinh do một số xạ khuẩn thuộc chi Micromonospora tạo ra. Trong thực tế chủng M. Purpurea var. nigrecens và M. Echinospora là nhuwngc chủng quan trọng nhất được ứng dụng vào sản xuất công nghiệp
Purpurea var. Nigrecens là chủng vi sinh vật hiếu khí, không hoặc rất ít tạo ra bào tử, do đó giống cần phải giữ trong điều kiện lạnh sâu đến -20 đến -30 độ C.
Micromonospora hàu như chỉ có khuẩn ty cơ chất phân nhánh, không hình thành khuẩn ty khi sinh. Đường kính khuẩn ty từ 0,4 đến 0,8 mcm. Khi chưa tạo bào tử, bề mặt khuẩn lạc có màu vàng sáng đến màu da cam hoặc đỏ nâu tùy thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy.
Quy trình lên men
Môi trường giữ giống %
Pepton: 0,6
Cao nấm men: 0,3
Cao thịt: 0,15
Casein thủy phân: 0,4
Glucose: 1
(NH4)2SO4: 0,35
KH2PO4: 0,1
MgSO4.7H2O: 0,5
Thạch: 2
Nước máy: vừa đủ
pH: 6,8-7
nhiệt độ: 28 độ C
môi trường nhân giống %:
tinh bột khoai tây: 1
bột đậu tương: 1
saccharose: 1
CaCO3: 0,4
CoCl2.6H20: 0,002
Nước máy: vừa đủ
Nhiệt độ nuôi cấy: 28 độ C.
Môi trường lên men %
Bột ngô: 2,5
Bột đậu tương: 3
Saccharose: 1
CaCO3: 0,4
CoCl2.6H20: 0,002
Anpha amylase: 0,001
Dầu phá bọt: 0,6
Nước máy vừa đủ
pH” 6,5- 6,7
nhiệt độ lên men: 28 độ C.
Lên men tạo gentamicin được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy chìm.
Quá trình này được thực hiện theo các bước cơ bản sau:
Giống -> hoạt hóa giống -> nhân giống các cấp -> lên men.
Giống thạch nghiêng được hoạt hóa trong môi trường giữ giống ở 28 độ C trong 4-5 ngày rồi cấy vào môi trường nhân giống cấp 1 và lắc 200-250 v/phút trong vòng 48 giờ, tiếp tục nhân giống cấp 2 với lượng guioongs cấy truyền 2-4% (nếu trong bình nón) và tiếp tục nhân giống, lượng giống cấy vào nồi lên men là 10-15 %. Quá trình lên men kéo dài khoảng 96=120 giờ, nhiệt độ thích hợp 26-28 độ C, pH 6,8-7,2. Cấp khi với lưu lượng 1 VVM. Hiệu suất chủng lên men thường không ổn định do sản phẩm là một hỗn hợp gồm nhiều loại gentamicin, có thể đạt đến 1500 mcg/ml hoặc cao hơn.
Chiết xuất và tinh chế
Dịch lên men được aicd hóa bằng dung dịch sulfuric 4N đến pH 2-2,5, để giải các kháng sinh, bổ sung chất trợ lọc, khuấy trộn rồi lọc bằng lọc trống hay khung ép lọc. Trung tính hóa dịch lọc bằng NaOH 40%, loại ion Ca ++ bằng acid oxaalic đến pH 3-3,5. Khuấy trộn rồi trung tính hóa lại pH ddeenss 7-7,5. Lọc lại tủa. Dịch lọc đã xử lý được chiết tách kháng sinh bằng nhựa trao đổi ion. Sau khi cột bão hòa, rửa cột bằng nước đã khử ion, phản hấp phụ kháng sinh bằng acid sulfuric 4N. Phân đoạn đậm đặc nhất được chỉnh về pH 4,5 bằng triethylamin, tẩy màu bằng than hoạt. Lọc loại than rồi dùng methanol tuả lấy sản phẩm thô với tỉ lệ dịch kháng sinh: methanol là 1:8,5. Lọc rửa tuả thô bằng methanol và aceton, sấy chân không ở 40 độ C và 40-70 mmHg. Sản phẩm thu được là gentamicin thô ở dạng muối sulfat.
Quá trình tinh chế gentamicin thô được tieena hành như sau:
Hào gentamicin vào nước cất, chỉnh pH về trung tonhs, tẩy màu bằng than hoạt, dịch lọc được đem sắc kí trao đổi ion, lấy phân đoạn đậm đặc nhất, cô chân không, tẩy màu bằng than hoạt, lọc loại than.tinh thể đem sấy khô rồi kiểm nghiệm và đóng gói.
