Lên men và chiết xuất vitamin B12

Lên men sinh tổng hợp

Để sản xuất có ba con đường sau:

• Chiết xuất từ bùn cống hoạt hóa

Một số vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn sinh metan sống kị khí trong bùn cống, ao, ruộng… có khả năng sinh ra vitamin B₁₂ với hàm lượng 0,5-1 mcg/1 g bùn khô. Nếu ủ bùn trong điều kiện kị khí hàm lượng vitamin B₁₂ có thể tăng lên. Có thể chiết xuất lấy vitamin B₁₂ thô từ bùn rồi bổ sung vào thức ăn gà, lợn. Hiện nay không sử dụng phương pháp này để sản xuất mà chỉ để kiểm tra độ ô nhiễm môi trường.

• Chiết từ nước thải của công nghiệp kháng sinh

Một số vi khuẩn như Streptomyces griseus sinh tổng hợp streptomycin, Str. Aureofacien tạo ta tetacyclin …, ngoài các kháng sinh còn tổng hợp vitamin B₁₂ từ 0,5-1 mcg/ml môi trường. Vì vậy sau khi chiết kháng sinh là sản phẩm chính người ta còn chiết vitamin B₁₂ từ nước thải bỏ đi đó. Từ 100 lít nước thải có thể thu được 40 mg vitamin B₁₂.

• Lên men sinh tổng hợp

Chủng giống: trong sản xuất dùng vi khuẩn Pripionibacterium shermanii vì cho hiệu suất cao nhất.

Đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn sinh vitamin B₁₂ : vi khuẩn Pripionibacterium shermanii thuộc Gram (+), là trực khuẩn nhỏ xếp thành đôi hoặc chuỗi ngắn không di động, sống kị khí hay hiếu khí bắt buộ. Trong điều kiện kị khí có hình cầu đường kính 0,5-0,6 micromet, trong điều kiện hiếu khí lại có hình que. Phát triển mạnh mẽ khi ở điều kiện kị khí.

Điều kiện nuôi cấy: sinh trưởng trong phạm vi Ph 4,5-7,5 nhưng thích hợp nhất là pH 6,8-7,0. Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B₁₂ là 28-30⁰C. Giới hạn tối đa cho sinh tổng hợp là 32⁰C.

Nguồn carcon: lên men được nhiều loại đường nhưng thích hợp nhất là glucose.

Nguồn nito: các amino acid, các muối amino. Methionin có tác dụng làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp vitamin B₁₂ từ 10-12%.

Các ion kim loại: bổ sung một lượng nhỏ muối cobalt sẽ tăng đáng kể hiệu suất sinh tổng hợp vitamin B₁₂, còn các kim loại sắt, đồng, kẽm, mangan làm giảm hiệu suất sinh tổng hợp vitamin B₁₂, nhất là sắt.

Các vitamin: có tác dụng kích thích sinh trưởng và làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp vitamin B₁₂ (gồm thiamin, biotin, acid nicotinic, acid folic…).

Quy trình chiết suất

vitamin B₁₂ là sản phẩm nội bào nên tồn tại trong sinh khối vi khuẩn. Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được đem lọc hoặc ly tâm thu lấy sinh khối, loại dịch trong. Tiến hành chiết xuất bằng dung môi hữu cơ hoặc nhựa trao đổi ion.

Hòa sinh khối vào nước tạo hỗn dịch và chỉnh pH về 4,5 bằng HCl 10% và thêm chất ổn định. Đun nóng hỗn hợp trong 80⁰C trong 30 phút để giải phóng vitamin B₁₂ vào dịch lọc. Lọc lấy dịch lọc, bỏ bã hoặc tận thu làm thức ăn chăn nuôi. Vitamin B₁₂ từ dung dịch nước sang pha hữu cơ bằng hỗn hợp dung môi phenol: n-butanol (1:1) với tỉ lệ V pha hữu cơ: V pha nước là 1:10. Dịch chiết hữu cơ này được pha loãng băng tricrezol và carbon tetraclorid (CCl₄) –sau đó chiết vitamin B₁₂ trở lại pha nước nhiều lần bằng nước.

Chỉnh pH pha dung dịch nước về 8,0-8,5 và tiến hành cyanid hóa. Sử dụng KCN để chuyển dạng vitamin B₁₂ coenzym thành Cyanocobalamin trong 3 giờ. Chỉnh pH về trung tính, cô chân không ở =< 60⁰C đến nồng độ vitamin B₁₂ đạt khoảng 10.000 mcg/ml.

Quá trình tinh chế được tiến hành trên cột oxyd nhôm. Hấp phụ dung dịch vitamin B₁₂ lên cột trong dung dịch aceton-nước 75%.sau đó phản hấp thụ thu lấy phân đoạn đậm đặc nhất.pha loãng dịch đậm đặc bằng aceton, khuấy nhẹ và để kết tinh 12 giờ ở 4⁰C. Lọc thu tinh thể hình kim màu đỏ đậm, rửa bằng aceton nguyên chất và sấy khô ở nhiệt độ thấp, hiện nay người ta chiết bằng nhựa hấp phụ XAD₂.